Calculando experimentos de secuenciación

Buenas,
hoy necesitábamos calcular cuántos individuos (de una especie monocotiledónea) podríamos secuenciar con cierta profundidad en un secuenciador Illumina, pensando en el HiSeq2500 en concreto. Al final decidimos apostar por una profundidad promedio de 80x, para is sobre seguro, usando parejas de lecturas de 2x125b. Buscando en Internet encontré rápidamente una calculadora del propio fabricante que igual algunos no conocéis y puede ayudar a hacer esto rápidamente.

Figura tomada de http://www.danielecook.com/calculate-depth-coverage-bam-file.

Vayamos con un ejemplo con la calculadora
[ http://support.illumina.com/downloads/sequencing_coverage_calculator.html ]:

0. tipo de secuenciación: DNA             [se puede elegir RNA también]
1. protocolo: whole-genome sequencing  [otras: Nextera, Truseq, custom]
2. tamaño del genoma: 320Mbp
3. profundidad deseada: 80x
4. % de duplicados: 2%                [valor por defecto]
5. instrumento: HiSeq 1500/2500

Volumen total de secuenciación requerido: 26,1Gb   [26.122.448.980b]

En mi ejemplo, usando el protocolo v4, esto equivale a 0.42 líneas o lanes, lo que significa que podría poner hasta 2 muestras por línea.

Hasta luego,
Bruno

PD Me dicen mis colegas Dave Des Marais y Pat Edger que la longitud de un genoma (de plantas en este caso)  puede estimarse aproximadamente a partir del contenido en DNA del núclo usando la fórmula long = 1C * 980.

Genotipado HLA y software disponible

En la presente entrada intentaré hacer una recopilación de software para el genotipado de HLA (MHC humano), en la sección de comentarios podéis añadir otras herramientas que intentaré incorporar al texto. Para escribir la entrada me resultó muy útil el siguiente post en Biostar forum y Omictools.

Antes de empezar es necesario mencionar que existe una base de datos muncial de alelos HLA denominada IMGT-HLA que recopila las miles de secuencias conocidas (y públicas) de genes y transcritos para esta familia. Todas las herramientas de genotipado emplearán las secuencias de esta base de datos para realizar sus predicciones.

Número de alelos registrados para cada tipo de HLA en la base de datos IMGT-HLA (Septiembre 2015).

Las herramientas de genotipado de HLA alinean (map) las reads de NGS a las secuencias de referencia de los principales loci HLA humanos presentes en la mencionada base de datos (clase I: HLA-A, HLA-B y HLA-C, clase II: HLA-DR y HLA-DQ).

Dependiendo del software, se puede procesar reads de secuenciación genómica, exómica o transcriptómica, aunque cuando se quieren analizar cientos/miles de individuos en un único experimento se suelen enriquecer por la técnica de secuenciación de amplicones (diseñando primers que amplifican las regiones menos conservadas, ver entrada anterior) o captura con sondas específicas para HLA.

El mapeo de reads a las secuencias de referencia puede realizarse directamente o tras realizar un ensamblaje de novo previo. Realizando un ensamblaje previo será más fácil encontrar alelos únicos de HLA puesto que los contigs resultantes darán menos mapeos ambiguos. Sin embargo el ensamblaje de esta familia de genes parálogos generará también un gran número de ensamblajes erróneos o quimeras (falsos contigs mezcla de dos secuencias análogas). A su vez el mapeo directo de reads puede generar ambigüedades puesto que numerosas reads alinearán con múltiples referencias a la vez.

Típica estrategia de genotipado por mapeado (alineamiento) de reads a sequencias de referencia. A la izquierda las reads son ensambladas de novo antes de ser alineadas. A la derecha las reads son directamente alineadas. Imagen modificada de Warren et al. (2012).

Listado de software para el genotipado de HLA

Sólo se listan herramientas libres para uso académico ordenadas por orden cronológico de la última versión del software:

• seq2HLA (Jun 2015): diseñado para procesar reads de RNA-Seq, mapea las mismas a las secuencias alélicas de referencia (IMGT-HLA) generando genotipos con una puntuación de probabilidad para los mismos y los niveles de expresión de los alelos predichos.
• HLAreporter (May 2015): primero filtra las reads que mapean a los diversos alelos de un único gen, las ensambla de novo y los contigs resultantes son de nuevo alineados a los alelos de referencia iniciales para asignar genotipos.
• HLAminer (Feb 2015): realiza un ensamblaje de novo de las reads (de casi cualquier procedencia) para después alinear los contigs resultantes contra los alelos de referencia.
• Optitype (Apr 2014): otro método que acepta diversos tipos de datos y también se basa en el mapeo a secuencias exónicas de referencia. Los resultados del mapeo son representados en forma matricial, las reads en filas y los alelos en columnas. En la matriz se identifican como máximo 2 alelos que explican el mayor número de reads mapeadas.
• PHLAT (Feb 2014): además de analizar datos genómicos, transcriptómicos y exómicos, ha sido también testado con datos de amplicones. Mapea reads a las secuencias de referencia seleccionando múltiples alelos candidatos y selecciona la pareja de alelos con la mayor probabilidad de acontecer juntos.
• HLAforest (Jan 2013): similar a seq2HLA, analiza reads de RNA-Seq, aunque puede ser usada con otro tipo de datos reduciendo su precisión.
• ATHLATES (Jun 2012): similar a HLAminer, filtra y ensambla las reads para después identificar exones de IMGT-HLA en los contigs ensamblados. Está diseñado para reads de sequenciación de exoma.
• GATK-HLA Caller (Dec 2011): similar a seq2HLA, alinea, filtra y calcula probabilidades para cada genotipo.

Por último explicaré el software diseñado en mi laboratorio...

• AmpliHLA (Sep 2015), no es el mejor, simplemente es diferente. Está únicamente enfocado al análisis de datos de secuenciación de amplicones usando primers que amplifiquen diferentes regiones de los genes HLA de interés y etiquetas de DNA que diferencien las muestras.

AmpliHLA requiere un pre-procesado online de los datos de NGS con la herramienta AmpliSAS. AmpliSAS clasifica las reads por muestra/individuo, corrige errores de secuenciación y filtra artefactos de secuenciación y PCR. AmpliSAS está diseñado para el genotipado de cualquier tipo de gen, especialmente si no tenemos alelos de referencia previos (como generalmente ocurre con muchos organismos cuyo genoma no ha sido secuenciado o regiones complejas del genoma como los genes que codifican las moléculas de MHC).

Un archivo Excel generado tras el análisis con AmpliSAS ha de ser introducido en el formulario de AmpliHLA y el programa automáticamente unificará marcadores (diversas regiones amplificadas de un mismo gen) y buscará sus secuencias en la base de datos humana para genotipar con la máxima precisión posible cada individuo. El principal inconveniente es el requerimiento de múltiples PCRs y diversos marcadores por gen para conseguir un genotipado de calidad. La principal ventaja es la obtención de un genotipado de-novo que permite descubrir alelos incluso si no están presentes en la base de datos humana.

Esquema de funcionamiento de la herramienta de genotipado de novo mediante secuenciación de amplicones: AmpliSAS. Primero las reads son separadas por muestras y marcadores. Después se realiza un clustering de los errores de secuenciación con sus secuencias de origen. Por último se filtran las reads minoritarias y se asignan alelos por cada muestra y marcador.

Secuenciación de amplicones y genotipado de alto rendimiento

Secuenciación de amplicones (SA)  es una traducción aproximada al español de la técnica de "Amplicon sequencing" que junto con las tecnologías de secuenciación masiva (del inglés new generation sequencing, NGS) permite genotipar cientos/miles de individuos en un único experimento.

La secuenciación de amplicones (SA) consiste en secuenciar los productos de múltiples PCRs. Un amplicón se define como el conjunto de secuencias obtenidas de cada PCR individual.

Antiguamente se realizaban PCRs individuales y se secuenciaban uno a uno los productos. Con las nuevas técnicas de NGS, podemos incluir etiquetas de DNA (por ej. una secuencia única de 6 nucleótidos) diferentes para cientos de muestras o individuos y clasificar más tarde las secuencias o reads resultantes de una única secuenciación (Binladen et al. 2007; Meyer et al. 2007).

Esquema de etiquetado y amplificación para la secuenciación de amplicones.

Mediante esta técnica podremos genotipar individuos y distinguir los diferentes alelos (con la secuenciación tradicional a veces es complicado separar alelos de un mismo gen). El principal problema de las técnicas de NGS es su alta tasa de error, que a su vez puede ser compensada incrementando la profundidad de secuenciación (el número de reads). Otros problemas pueden ser los errores de la polimerasa o la generación de quimeras (una secuencia mezcla de otras).

En el siguiente enlace podemos ver un vídeo explicativo del proceso de secuenciación de amplicones:
http://www.jove.com/video/51709/la-secuenciacin-de-prxima-generacin-de-16s-arn-ribosomal-genes?language=Spanish

Básicamente existen 4 etapas en el análisis por AS con NGS:

1. Diseño experimental de los primers usados para amplificar los genes de interés (marcadores) y las etiquetas a usar para distinguir los diferentes individuos o muestras.
2. Amplificación por PCR de los marcadores en el laboratorio, generalmente se realiza una PCR por cada muestra.
3. Secuenciación de los productos de amplificación. Las tecnologías de NGS más usadas para SA son: Illumina, 454 e Ion Torrent.
4. Análisis bioinformático de los datos de secuenciación. El análisis incluye separación de las reads en amplicones, corrección de errores de secuenciación, filtrado de reads minoritarias/contaminantes y generación de genotipados.

Etapas de la técnica de secuenciación de amplicones mediante NGS.

Aplicaciones 

SA es utilizado para realizar clasificaciones taxonómicas usando genes como: cytochrome c oxidase subunit 1 (CO1), genes rRNA (16S/18S/28S), genes específicos de plantas (rbcL, matK, and trnH-psbA) y espaciadores internos nucleares (ITSs) (Kress et al. 2014; Joly et al. 2014). Los genes anteriores se distinguen por una tasa de mutación suficientemente rápida como para distinguir especies cercanas y a la vez suficientemente estables como para distinguir congéneres.

Lista de genes habitualmente usados como marcadores taxonómicos (fuente: Kress et al. 2014)

Un experimento pionero de SA fue la determinación de la diversidad microbiana en aguas marinas profundas (Sogin et al. 2006), usando primers flanquenado la región V6 hipervariable de la subunidad 16S rRNA bacteriana. Dicho estudio descubrió miles de poblaciones minoritarias de organismos no conocidos con anterioridad.

Otro gran campo de aplicación es el genotipado de familias de genes de alta complejidad, como el complejo mayor de histocompatibilidad, que poseen múltiples loci y diferente número de copias entre individuos, incluso de la misma especie (Babik et al. 2010; Lighten et al. 2014). El complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I y II codifica receptores celulares que presentan antígenos a las células del sistema inmune y son los genes más polimórficos conocidos en vertebrados . El MHC humano también se conoce como HLA (Human Leukocyte Antigen) y juega un papel clave en la compatibilidad en el transplante de órganos. Los loci del MHC son tan polimórficos que no hay dos individuos en una población no endogámica que posean el mismo conjunto de alelos (excepto gemelos).

Estadísticas del número de alelos conocidos para la familia de genes del HLA (fuente: base de datos IMGT-HLA)

Hasta hace poco era necesario clonar y secuenciar uno por uno los diferentes alelos de este tipo de genes para conseguir una secuencia fiable. Actualmente tan tediosa tarea puede ser simplificada mediante un único experimento de NGS que incluya múltiples individuos y múliples genes. El secuenciador de nueva generación (ej.: Illumina, 454 o Ion Torrent) leerá las sequencias individuales de cada uno de los alelos. Actualmente existen incluso kits comerciales para simplificar el proceso: Illumina TruSeq Custom Amplicon, Roche 454 Fluidigm Access Array or Life Technologies Ion Torrent Ion AmpliSeq.